一、钙离子成像手艺（Calcium imaging）
钙离子成像手艺（Calcium imaging）是指使用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的要领。 。在神经系统研究中，，，，我们常用钙离子成像手艺监测神经元内钙离子的转变，，，，提醒神经元运动。 。有了钙成像手艺，，，，原本悄无声息的电心理运动就酿成了一幅形象地、美丽闪灼的壮观影像，，，，研究职员可以同时大宗追踪神经元运动，，，，研究其关系，，，，因而被全天下神经科学家们追捧。 。
图1.钙离子成像手艺
1）钙离子成像手艺原理
在生物体内，，，，钙离子是细胞信号爆发的基础，，，，在许多功效方面有主要作用。 。在哺乳动物的神经系统中，，，，钙离子是一类主要的神经元胞内信号分子，，，，神经元静息状态下，，，，胞内钙离子浓度约为50-100nM，，，，而当神经元运动的时间，，，，胞内钙离子浓度能上升10-100倍，，，，而钙离子关于突触囊泡释放必不可少；；神经元在放电的时间会爆发出一个短暂的钙离子浓度岑岭，，，，这意味着神经元钙离子浓度表征突触转达和神经元运动。 。
图2 神经元钙离子浓度表征突触转达和神经元运动示意图
因而，，，，神经元钙离子成像手艺的原理就是借助钙离子浓度与神经元运动之间的严酷对应关系，，，，使用特殊的荧光染料或者卵白质荧光探针（钙离子指示剂，，，，Calcium indicator），，，，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度体现出来，，，，并被显微镜捕获，，，，从而抵达监测
神经元运动的目的（图3）。 。
因而，，，，钙离子成像手艺的焦点在于钙离子指示剂，，，，现在普遍使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂（chemical indicators）和基因编码钙离子指示剂（genetically-encoded indicators）两类：
1、化学性钙离子指示剂：指的是可以螯合钙离子的小分子，，，，所有这些小分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），，，，BAPTA能够特异性地和钙离子螯合，，，，而不会和镁离子螯合，，，，以是被普遍地用作钙离子螯合剂。 。现在较为成熟的化学性钙离子指示剂包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。 。
2、基因编码钙离子指示剂：这些指示剂是来自于绿色荧光卵白（GFP）及其变异体（例如循环排列GFP、YFP、CFP）的荧光卵白质，，，，与钙调卵白（CaM）和肌球卵白轻链激酶M13域融合。 。现在使用较普遍的基因编码钙离子指示剂有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，，，，其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度，，，，现在被普遍应用于活体钙成像研究，，，，其发出荧光的原理在于钙离子浓度上升导致M13与CaM连系，，，，从而改变cpEGFP的构象，，，，将其从无荧光的状态变为绿色荧光
图3 GCaMP卵白的基本结构和原理（来自WIKI）
2）常见的钙离子指示剂
1、GCaMP6系列：
第六代GCaMP卵白（GCaMP6）有三种差别亚型：GCaMP6s、GCaMP6m、GCaMP6f，，，，其特点各不相同（图4）。 。GCaMP6s高敏感，，，，适合低频信号的指示，，，，；；GCaMP6f有快速动力学曲线，，，，解离最快，，，，适合高频信号的指示，，，，需要凭证实验需求举行选择。 。
图4 几种差别GCaMP卵白的特征（Douglas S. Kim, et al., Nature, 2013）
2、jGCaMP7家族：
jGCaMP7（Janelia GCaMP7，，，，区别于已往泛起过的G-CaMP7）。 。包括四类差别特点的卵白：jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b、jGCaMP7c（图5）。 。jGCaMP7s高敏感；；jGCaMP7f具有快速动力学曲线，，，，适用于更强的检测单行动电位反应或群里运动实验；；jGCaMP7b具有较明亮的配景荧光，，，，适用检测神经元突起或神经纤维；；jGCaMP7c的本底荧光最低，，，，比照度高，，，，信号清晰，，，，适用于大规模成像。 。
图5 jGCaMP7卵白的反应特点（Douglas S. Kim, et al., bioRXiv, 2018）
3、XCaMP系列：
基于CaMKK为骨架，，，，通过一系列的突变筛选，，，，包括四种差别颜色：蓝色的XCaMP-B，，，，绿色的XCaMP-G，，，，橙色的XCaMP-O和红色的XCaMP-R（图6）。 。其中XCaMP-G的荧光强度比GCaMP6强，，，，行动电位刺激诱发的钙离子反应性能也比GCaMP6有显着提高。 。连系特定的神经元特异的表达要领，，，，可实现在自由运动状态下同时监测特定行为中三种差别神经元类型的运动；；连系双光子显微镜，，，，举行微结构功效成像，，，，实现对突触前和突触后结构同时双色成像。 。
图6 XCaMP卵白特点（Haruhiko Bito’s, lab.,cell, 2019）
4、CaMPARI：
一种能够兼顾全局和微观的新型钙成像手艺，，，， 包括CaMPARI以及CaMPARI2（第二代）。 。其原理在于，，，，CaMPARI卵白在正常状态下会发出绿色荧光，，，，而若是对这种卵白同时使用高浓度钙离子与紫外光处置惩罚，，，，它就会不可逆、永世地转酿成另一种能发出红色荧光的构象，，，，即实现将瞬间的神经元运动酿成永世的红色荧光卵白表达（图7）。 。研究职员通过转基因手艺将这种新型卵白导入到实验动物的神经系统中，，，，然后用高强度的紫外光照射动物的大脑，，，，通过检查荧光，，，，找到发红色荧光的神经元，，，，这些神经元即是在紫外光照射时代活跃的神经元。 。由于紫外光可以对着整个大脑举行照射，，，，以是理论上，，，，人们可以对全脑举行检查。 。
图7 CaMPARI手艺原理（Eric R. Schreiter, et al., Science, 2015）
5、jRGECO1a&RCaMP：
红色的钙离子敏感卵白，，，，可以同GCaMP一起使用，，，，标记统一小鼠统一脑区两类细胞的运动差别的神经元类型。 。
6、GCaMP-X：
无损伤钙离子探针，，，，可；；ひ览涤贚型钙通道的兴奋-转录耦合免受滋扰，，，，同时仍体现出部分GCaMP的优良Ca2+感应特征。 。
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二、电压成像（voltage imaging）
细胞内钙离子浓度转变和细胞膜电位的转变是细胞运动的两个主要指标，，，，由于钙信号衰减较慢，，，，并不可充分表征神经元的行动电位，，，，并且阈值以下的电压信号完全被忽略，，，，于是科学家们使用细胞膜电位改变作为信号举行荧光成像。 。
1)电压成像手艺原理
细胞膜电位转变是细胞运动最基本的信号，，，，当膜电位转变时，，，，细胞膜上镶嵌的许多卵白质分子都会改变形状，，，，这类随膜电位改变形状的卵白分子叫电压敏感元件。 。而电压成像手艺原理就在于将电压敏感元件和荧光卵白毗连起来，，，，当膜电位改变时，，，，电压敏感卵白的改变就会影响荧光卵白的结构，，，，从而改变了后者的发光特征。 。这样就可以使用荧光来看神经细胞膜的膜电位转变了。 。
遗传编码的荧光电压指示剂（Genetically encoded voltage indicators, GEVIs）刷新于一种细菌能吸收阳光的卵白质--古紫质Archaerhodopsin，，，，其能随着细胞膜电位改变发出荧光。 。通过GEVIs我们可以成像神经元的快速放电信号与阈下电运动，，，，能实时监测细胞膜电位的波动，，，，相比于钙指标，，，，更能直接反应神经元的活性。 。
图8 三种类型GEVIs的示意图（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）
Voltron，，，，是一种新型电压指示剂，，，，差别于古板的GEVIs依赖于微生物视紫红质或荧光卵白（这些荧光基团缺乏亮度与光稳固性），，，，Voltron使用明亮且耐光型的合成染料。 。其原理在于Voltron将电压敏感性微生物视紫红质结构域和自标记卵白标记域连系染料连系，，，，后者可共价连系一种人工荧光染料配体，，，，合成染料给药方法简朴，，，，且可跨血脑屏障。 。体内同时成像神经元的数目扩大10倍，，，，且成像时间越发长期。 。
图9 Voltron结构的示意图（Eric R. Schreiter’s lab., science, 2019）
神经元功效成像是探讨神经元编码种种功效的主要科学手段，，，，普遍应用于神经生物学等各个研究领域，，，，现在最常用要领为钙成像和电压成像。 。得益于双光子成像手艺，，，，通过纪录细胞内钙离子浓度转变或细胞电位转变，，，，实时反应细胞运动，，，，实现了一系列行为动物活体动态功效成像手艺！
三、神经递质荧光探针
在已知宇宙中，，，，脑可能是最重大的物体之一。 。凭证前人的预计，，，，UG环球脑约莫有1010-1012个神经元和1011-1013个胶质细胞，，，，同时每个神经元拥有103-104个突触与其他神经元形成联系。 。神经递质作为突触间转达信息的主要“信使”，，，，在神经元与细胞之间的通讯交流中起到要害的前言作用，，，，神经递质的杂乱经常陪同种种疾病的爆发。 。因此,对神经递质的探测追踪是研究大脑功效和相关疾病的主要环节。 。然而，，，，怎样在拥有数十亿个神经细胞、数万亿个突触毗连的大脑中准确检测神经递质的释放，，，，是恒久以来困扰科学家的一个难题。 。
北京大学李毓龙团队使用可与神经递质相连系的G卵白偶联受体作为探针的骨架，，，，将荧光卵白（cpEGFP）与特异性的人源神经递质受体巧妙地举行分子水平的融合和刷新，，，，乐成开发出新型可遗传编码的一系列神经递质荧光探针。 。
1）神经递质荧光探针原理
这一系列神经递质探针原理类似，，，，都是基于人源神经递质受体，，，，其原理在于把cpEGFP嵌入特定的神经递质受体，，，，受体与神经递质连系后会引发受体构象改变转换为荧光信号（图10）。 。
现在通过病毒注射、转染等手艺手段，，，，可以将这种可遗传编码的探针表达在细胞或小鼠脑部，，，，借助成像手艺，，，，视察神经递质浓度的实时转变。 。这类神经调质探针具有极高的迅速度、分子特异性、准确的空间区分率和亚秒级响应速率，，，，已在果蝇、斑马鱼。 。小鼠脑部十几种神经元上获得验证，，，，这将为研究大脑的功效以及神经系统疾病机制的剖析提供主要的工具。 。
图10 GACh原理（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）
2)常见的神经递质荧光探针
1、DA
多巴胺是大脑中一种主要的神经递质，，，，调控包括学习、影象、运动等一系列要害功效，，，，多巴胺失调会导致精神疾病或神经退行性疾病，，，，多巴胺探针包括：DA1h和DA1m两种版本，，，，划分对应高/低亲和力，，，，适用于多巴胺释放量差别的脑区（图11）。 。
图11 GRABDA sensors表达在细胞和神经元中（Yulong Li’s lab., cell, 2018）
2、Ach
乙酰胆碱是人类发明的第一种神经递质，，，，认真调理睡眠、成瘾、学习影象等历程。 。乙酰胆碱信号转达失常，，，，会导致先天性肌肉萎缩、糖尿病、阿兹海默症等疾病。 。GACh2.0对心理浓度乙酰胆碱具有高信噪比、高迅速性的光学信号转变响应，，，，并且具有亚秒级动力学及高度分子特异性，，，，可实现对时空特异性乙酰胆碱信号的准确指征（图12）。 。
图12 GACh2.0 sensors特征（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）
3、NE
去甲肾上腺素作为一种主要的单胺类神经递质，，，，加入感受信号的调理、注重力调控、睡眠于醒觉、学习影象等心理历程，，，，去甲肾上腺素释放或信号转达的受损与一系列的精神疾病和神经退行性病变息息相关。 。去甲肾上腺素探针包括：NE1m和NE1h两种版本，，，，划分对应高/低亲和力，，，，适用于检测局部突触转达和非局部非突触转达的去甲肾上腺素释放（图13）。 。
图13 GRABNE sensors表达神经元（Yulong Li’s lab., Neuron, 2019）
别的，，，，李毓龙教授团队正在起劲开发更多新的神经递质、神经肽等荧光探针。 。
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成像手艺应用案例
1、GCaMP6f
客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 醒觉]
注射部位：小鼠PVT
载体：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射体积：100nl
视察时间：4周
2、GCaMP6s
① 客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传, 化学遗传，，，，钙成像]
注射部位：小鼠PBN
载体：AAV-hSyn-GCaMP6s
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.3x1012 VG/mL
注射体积：300nl
视察时间：3周
② 客户揭晓文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]
注射部位：小鼠皮层M1、PMC
载体：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL
注射体积：多点注射，，，，每位点30-40nl
视察时间：4周
3、GCaMP5G
客户揭晓文章：Neuron. (IF=14.319). Han Q,et.al. (2018). A Visual-Cue-Dependent Memory Circuit for Place Navigation. [AAV, 学习与影象, 钙成像]
注射部位：小鼠MECII
载体：pAAV-Syn-GCaMP5G
血清型：rAAV2/9
注射体积：约100nl
视察时间：4周
