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688238 腺相关病毒

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疾病研究（心、肝、肺）

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　　基于对病毒载体的深入相识和研发，，，越来越多的科研职员最先借助病毒载体举行疾病研究。。。现在，，，病毒载体工具在差别组织器官中均有大宗的应用，，，通过使用工具病毒载体，，，对疾病相关基因举行定向和组织特异性的刷新和操控，，，已成为科研职员举行疾病研究与治疗的一种手艺手段。。。

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　　病毒载体的选择

　　

　　差别病毒载体的巨细迥异，，，意味着其内含基因容量保存重大差别；；免疫原性的差别，，，意味着其体内/体外应用的场景需要细微调解；；表达时间和周期的差别，，，意味着我们需要凭证研究需求举行相对应的选择。。。

表1 差别病毒的生物学特征较量

	慢病毒	腺相关病毒	腺病毒	逆转录病毒
包膜	有	无	有	有
颗粒直径	80-100 nm	20-30 nm	90-100nm	~100nm
基因组	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
基因组巨细	9.75kb	4.7kb	36kb	~5kb
表达起始时间	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表达一连时间	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
体内扩散能力	一样平常	强	强	一样平常
免疫原性	中等	极低	强	中等
滴度规模	10⁸~10⁹TU/mL	10¹²-10¹³VG/mL	10¹¹-10¹²PFU/mL	10⁷~10⁸TU/mL
滴度检测要领	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗体免疫染色试剂盒	qPCR整合DNA
整合方法	随机高频整合	定向低频整合（rAAV不整合）	非整合	随机整合
应用规模	体外细胞熏染，，，gRNA文库筛选，，，体内	基于差别的血清型，，，体内普遍应用	嗜肝，，，快速表达或短期表达，，，血液、心脏，，，细胞系等	特异性只熏染破碎期的细胞

　　重组腺相关病毒载体（rAAV），，，一直是体内研究的明星载体，，，除了其免疫原性极低、清静性高、宿主细胞规模广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势外，，，还在于其种类多样性。。。

　　

　　现在研究中常用的rAAV就是使用AAV2型基因组与差别的衣壳卵白连系爆发的混淆体病毒载体，，，一样平常标记为rAAV2/N (N为差别的衣壳血清型)。。。重组的病毒具有AAV2型的稳固表达和基因整合能力，，，同时获得了差别血清型的组织熏染嗜亲性，，，体现出一定的器官靶向特异性。。。

表2 差别血清型AAV的组织嗜亲性

血清型	组织亲和性
rAAV2/1	神经系统（高滴度顺向跨突触），，，肌肉，，，骨骼肌，，，心肌，，，平滑肌
rAAV2/2	神经系统，，，肌肉，，，肝脏，，，血管平滑肌，，，眼
rAAV2/3	肌肉，，，肝脏，，，肺，，，眼
rAAV2/4	神经系统，，，肌肉，，，眼，，，脑
rAAV2/5	神经系统，，，肺，，，视网膜，，，肝脏，，，滑膜枢纽
rAAV2/6	神经系统，，，肺，，，肌肉，，，心脏
rAAV2/7	肌肉，，，肝脏
rAAV2/8	神经系统，，，肝脏，，，胰腺，，，视网膜，，，脂肪组织
rAAV2/9	神经系统，，，心肌，，，肺，，，视网膜，，，皮肤，，，肌肉，，，脂肪组织
rAAV2-retro	神经系统（逆向非跨突触）
AAV-PHP.eB	跨血脑屏障（静脉注射）
AAV-PHP.S	全外周神经（尾静脉注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾静脉注射）
AAV-DJ	视网膜，，，肺，，，肾脏，，，体外熏染细胞
AAV-7m8	视网膜
AAV-ShH10Y	视网膜Muller细胞
AAV-Rh10	肝脏，，，血液，，，心脏，，，体外熏染细胞
AAV-Anc80L65	内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9	SVZ区神经干细胞

　　小建议：如您不确定选择哪种血清型，，，可实验使用UG环球生物Pandora’s Virus （AAV试用装）举行预实验，，，通过较量差别血清型对目的组织的熏染效果，，，探索最佳实验条件（注射要领、注射位点、病毒用量等），，，以便获得更理想的实验效果。。。（链接到Pandora’s Virus＞＞）

肝脏

　　肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的主要器官，，，其功效异常�；岬贾轮靖巍⒏叩ü檀佳ⅰ⒏哐ⅰ⑻悄虿〉燃膊�。。。

　　

　　1、注射方法

　　

　　应用病毒载体熏染肝脏一样平常接纳尾静脉注射的方法。。。

　　

　　凭证UG环球生物多年的履历，，，使用AAV载体熏染肝脏组织一样平常选取AAV2/8血清型，，，通过尾静脉注射手段熏染肝脏每只小鼠需要注射1x10¹⁰总滴度的病毒载体。。。

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　　UG环球生物AAV熏染效果

　　

　　2、应用案例

　　

　　2.1 肝脏特异启动子TBG

　　

　　客户揭晓文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，，，自噬溶酶体，，，腺相关病毒过表达]

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　　注射方法：小鼠尾静脉注射

　　

　　载体：AAV8-TBG-Fabp1

　　

　　血清型：rAAV2/8

　　

　　注射量：200ul，，，2× 10¹¹ VG

　　

　　视察时间：1周

　　

　　2.2 Cre-loxp手艺在小鼠肝脏中的应用

　　

　　由于腺病毒高度嗜肝，，，险些90%以上会熏染肝脏，，，因此腺病毒可以作为肝脏特异性熏染的有用载体。。。将Cre腺病毒（Ad-Cre）通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内，，，即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除，，，从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。。。

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　　2.3 CRISPR/Cas9手艺在小鼠肝脏中的应用

　　

　　通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠体内，，，可以实现在肝脏中特异性表达，，，并实现肝脏部位的特异性敲除。。。此要领较量适合磨练活体实验。。。

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胰腺

　　胰腺是一个兼有内、外渗透功效的器官，，，与机体消化、血糖代谢、脂质代谢等有亲近的关系，，，也是代谢研究的要害目的器官之一。。。

　　

　　在现实研究中，，，使用病毒载体熏染胰腺主要有两种方法，，，一种是使用AAV2/8病毒载体，，，通过胆管将病毒注射入胰腺；；另一种新要领是使用UG环球生物新研发的AAV-PAN病毒载体，，，腹腔注射熏染胰腺：

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UG环球生物AAV-PAN熏染效果

心脏

　　1、注射方法

　　

　　AAV的注射方法，，，差别的文章中接纳了纷歧样的注射方法。。。总体上，，，一样平常包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），，，其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。。。

　　

　　尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环，，，漫衍较匀称。。。心腔内注射需要连系自动脉嵌夹举行，，，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，，，敌手术操作要求较高。。。心肌内定点注射时每点注射2-5ul，，，效果是在注射的局部点周围表达较高，，，但扩散很是有限。。。总的来说，，，许多实验直接用尾静脉注射即可，，，可是可能需要较高剂量的病毒，，，若是专心肌内定点注射，，，即小量多点注射，，，可以抵达很好的熏染表达效果，，，可是后者操作手艺难度略高，，，也需要破费更长的操作时间。。。

　　

　　连系新生鼠（出生2-10天）注射效果较量来看，，，新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠，，，消耗病毒剂量也相对较低。。。新生鼠的注射，，，一样平常凭证实验室的条件来看，，，可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内（左心室）注射，，，目的是将病毒导入血液循环中。。。

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　　2、启动子选择

　　

　　一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。。。许多高效的启动子由于片断较大，，，如αMHC，，，仅用于转基因小鼠等实验，，，不适合装载在AAV载体上。。。通过查阅文献，，，我们发明一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力较量强，，，特殊关于大片断的驱动效果很显着，，，可是若是需要介导的目的基因在心脏中特异性表达，，，则推荐使用cTnT启动子，，，cTnT常被用于心肌的特异性表达，，，表达能力也很强。。。

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　　3、应用案例

　　

　　3.1 心脏特异性启动子cTNT

　　

　　客户揭晓文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.

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　　注射方法：

　　

　　载体：AAV9

　　

　　血清型：rAAV2/9

　　

　　启动子：cTnT

　　

　　注射量：200ul，，，2× 10^{11^VG}

　　

　　视察时间：1周

　　

　　3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠

　　

　　科学家构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因小鼠，，，通过Myh6基因的启动子（αMHC）驱动Cas9在心肌的特异性表达。。。αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。。。这个工具小鼠能够解决实验历程中Cas9在心脏递送和表达的难题。。。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏恒久高水平的表达，，，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。。。

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　　Cas9转基因小鼠，，，只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现，，，这种要领可以获得较量高的编辑效率。。。研究职员将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠，，，实现心脏特异性敲除。。。Myh6表达水平降低50%以上，，，同时乐成获得爆发心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。。。

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肺部

　　现在关于肺部的病毒熏染，，，普遍接纳AAV病毒载体，，，使用病毒载体熏染胰腺主要有两种方法，，，一种是使用AAV2/9病毒载体，，，通过鼻内或气管内递送（经呼吸道）将病毒通过肺呼吸道递送，，，参考剂量是1×10¹¹VG病毒，，，体积50ul；；另一种新要领是使用UG环球生物新研发的AAV-LUNG病毒载体，，，尾静脉注射特异性熏染肺部：

　　

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　　UG环球AAV-LUNG熏染肺部效果

肌肉

　　现在，，，关于肌肉组织中使用的病毒载体通常�；嵫∮肁AV病毒载体，，，由于AAV不但能够高效特异地靶向肌肉组织，，，且能在肌肉组织中表达长期。。。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应，，，并且很容易被扫除，，，表达时间较量短暂，，，较少被应用于肌肉组织的靶向表达。。。只管慢病毒熏染表达规模普遍，，，对作育的肌肉细胞均能高效表达，，，可是对肌肉组织的熏染表达很是有限。。。现在靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1，，，AAV6和AAV9。。。其中，，，AAV9的表达效率最高，，，并且更容易在肌肉中高表达。。。

　　

　　1、注射方法

　　

　　应用病毒载体熏染肌肉组织举行研究，，，一样平常分为系统注射和肌肉内注射，，，系统注射表达较匀称，，，可是大部分病毒会被其他脏器组织吸收，，，导致靶向肌肉的病毒较少。。。肌肉内注射是一种定点注射，，，可以在注射点周围高效表达，，，但弱点是病毒扩散十分有限，，，因此往往需要多点注射，，，一样平常每个点在5-10ul。。。

　　

　　2、应用案例

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　　注射方法：静脉注射

　　

　　载体：AAV-CMV-miniDystrophin

　　

　　血清型：rAAV2/9

　　

　　视察时间：16周

脂肪组织

　　脂肪组织由大宗脂肪细胞组成，，，分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织，，，脂肪组织是机体冗余能量贮存的主要器官，，，同时也是主要的渗透器官，，，在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤修复等中有主要的心理功效。。。

　　

　　研究中，，，若是我们使用病毒载体熏染脂肪组织，，，一样平常接纳定点注射的方法。。。使用AAV病毒载体熏染脂肪组织一样平常选取rAAV2/8血清型，，，在脂肪组织的多点注射中，，，每个点注射量约莫1x10¹⁰总滴度的病毒载体。。。

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　　AAV熏染脂肪

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