最近科研界什么较量盛行 ？？？ ？ ？？
外泌体（Exosomes）是当之无愧的热门话题。。岂论在肿瘤领域、神经科学领域照旧代谢领域，，都有大宗的外泌体相关文章揭晓，，以探讨外泌体的功效和机制。。
要研究外泌体的功效，，一样平常都会在细胞和动物水平划分举行验证，，这个历程势必涉及到外泌体的示踪（标记），，我们这次综合多篇文献，，整理了外泌体示踪用到的要领。。别的，，有许多研究者对外泌体的动物注射用量也有较多疑问，，这次一并整理给各人做参考。。
外泌体示踪：
1. 亲脂性染料标记
现在已揭晓的外泌体文章中，，外泌体大多使用亲脂性染料举行标记，，体内和体外都有较多应用。。亲脂性染料主要分为两大类，，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），，由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳固连系，，以是染色效果较好，，应用较普遍。。
图1 PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用
Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
图2 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共作育
Cancer Sci. 2019 Oct;110(10):3173-3182.
第二类是Di系列的亲脂性染料，，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，，在活体成像中用来示踪。。
图3 DiI标记的外泌体通过静脉注射视察在体内器官的漫衍情形
J Cereb Blood Flow Metab. 2018 May;38(5):767-779.
图4 DiO标记的外泌体与HCT116细胞共孵育
BMC Cancer. 2018 Jan 6;18(1):47.
图5 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模子
J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.
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2.慢病毒介导CD63-GFP表达
将外泌体的特定卵白CD63和绿色荧光卵白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，，随后用此慢病毒熏染细胞，，使细胞渗透的外泌体带有绿色荧光。。
图6 用GFP标记的外泌体划分与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共作育
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
图7 注射有CD63-GFP的外泌体后视察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
3.用金纳米颗粒（Gold nanoparticles，，GNPs）标记
将金纳米颗粒标记的外泌体通过鼻内给药不但能举行无创跟踪，，并且能增进外泌体在脑部的积累和延伸在病变区域的保存时间，，增强体内神经成像的效果。。因此，，这种外泌体标记手艺可以作为多种脑疾病的强盛诊断工具，，并可能增强基于外泌体的神经恢复治疗。。
图8 金纳米颗粒外泌体的制备及体内注射
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
图9 用金纳米颗粒和PKH26对外泌体举行双标记
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
4.用近红外（NIR）荧光探针举行标记
这是一种使用两亲性探针对NIR荧光标记的外泌体举行内源性检测的要领，，无需对外泌体举行免疫标记或合成或色谱处置惩罚。。由于NIR波长的荧光探针能穿透体内组织，，从而提供了从细胞直接转换到体内使用的利益。。
图10 未标记外泌体和NIR标记外泌体的原子力显微镜图片
Chem Commun (Camb). 2018 Jun 26;54(52):7219-7222.
5.用Gaussia luciferase（gluc）和截断的lactadherin标记
将gLuc-lactadherin组成融合表达的质粒，，再将此质粒转染细胞，，使细胞渗透的外泌体带有强的萤光素酶活性。。将标记的外泌体举行静脉注射入小鼠体内，，看外泌体在组织的漫衍情形。。
图11 将表达了gluc-lactadherin的外泌体静脉注射入Balb/c小鼠
J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.
小结1
外泌体标记对探讨外泌体的功效是必不可少的一个办法，，首先需要视察到外泌体被受体细胞吸收或抵达目的组织、器官，，再检测受体细胞、组织或器官中响应指标的转变，，看外泌体是否具有一定的功效。。确定外泌体具有功效后，，再通过高通量测序或基因芯片举行差别表达分子的挖掘，，进一步深入研究机制。。
外泌体的动物注射用量总结
案例1：
外泌体泉源：间充质干细胞
标记方法：C5 Maleimide-Alexa 594
注射方法：脑室注射
注射用量：每只小鼠1.5mg/ml、20ul
视察部位：海马
炎症反应检测时间：4 days
文章泉源：Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a nanotherapeutic agent for amelioration of inflammation induced astrocyte alterations in mice
案例2：
外泌体泉源：巨噬细胞
标记方法：PKH26
注射方法：静脉注射
注射用量：每只小鼠30ug，，每7days注射一次
视察部位：肝脏、脂肪组织、肌肉
葡萄糖、胰岛素检测时间：12 days
文章泉源：Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity
案例3：
外泌体泉源：血清
标记方法：PKH67
注射方法：静脉注射
注射用量：每只小鼠约3-5*10的10次方particles/ml，，200ul
视察部位：肺部
肺部炎症反应检测时间：24 h
文章泉源：Peripheral Circulating Exosome-Mediated Delivery of miR-155 as a Novel Mechanismfor Acute Lung Inflammation
案例4：
外泌体泉源：CAR-T细胞
标记方法：NHS-Rhodamine (Rho)
注射方法：静脉注射
注射用量：每只小鼠100-150ug，，每周注射一次
视察部位：肿瘤组织
抗肿瘤活性检测时间：5-40 days
文章泉源：CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity
小结2：
动物的外泌体注射可以接纳定位注射和静脉注射等，，差别注射要领外泌体的用量差别，，别的，，差别的外泌体泉源用到的外泌体量也差别，，建议在做动物注射正式实验之前，，可以先做个预实验，，探索合适的外泌体用量，，一方面既可以展现外泌体的功效，，另一方面也可以确保动物的存活率。。
