光遗传学（optogenetics）是连系了光学（optics）及遗传学（genetics）的手艺，，，，，，借助其，，，，，，我们能在活体动物甚至是自由运动的动物脑内、脊髓、外周神经内，，，，，，精准地控制特定种类神经元的运动。 。。。 。光遗传学在时间上的准确度可抵达毫秒级别，，，，，，在空间上的准确度则能抵达单个细胞级别。 。。。 。2010年，，，，，，光遗传学被Nature Methods选为年度要领，，，，，，同年被Science以为是近十年来的突破之一。 。。。 。这项手艺现在在神经科学领域应用很是普遍，，，，，，未来可能会应用于多种神经和精神疾病的治疗，，，，，，如帕金森氏病、阿尔茨海默病、癫痫、脊髓损伤、精神破碎症等。 。。。 。
光遗传学手艺基来源理
简朴地说，，，，，，光遗传学手艺即借助遗传学手段，，，，，，将能够对光起响应的通道卵白表达在特定细胞中，，，，，，实现通过光来激活或抑制神经元运动的目的。 。。。 。其中，，，，，，激活或抑制的原理在于差别通道对阳离子或阴离子的通透：若是转入细胞的通道是ChR通道，，，，，，那么在细胞接受蓝色激光照射时通道开放，，，，，，阳离子内流，，，，，，会爆发去极化电位，，，，，，诱刊行动电位的发出，，，，，，激活细胞；； ；；；若是转入细胞的是HR一类通道的话，，，，，，细胞接受黄色激光照射时阴离子内流，，，，，，爆发超极化电位，，，，，，导致行动电位不易发放，，，，，，抑制细胞运动；； ；；；别的，，，，，，尚有一类光激活或抑制的通道optoXR，，，，，，给光激活后其改变的是胞内激酶系统，，，，，，影响细胞运动。 。。。 。因此，，，，，，光遗传学手艺的焦点手艺差别在于光敏感通道的选择。 。。。 。
光遗传学的基来源理（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）
常见的光敏感通道
几种激活神经元的通道卵白：
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ChR2(H134R)：470nm蓝光引发。 。。。 。ChR2的突变体，，，，，，该卵白质可以爆发两倍的光电流，，，，，，但通道开关速率也比野生的ChR2慢了一倍。 。。。 。
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ChETA：470nm左右蓝光引发。 。。。 。ChR2的突变体，，，，，，具有更快的动力学转变，，，，，，某些神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike。 。。。 。
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oChIEF：450nm-470nm蓝光引发。 。。。 。在某些神经元中可以响应高频光（--100Hz）刺激，，，，，，加速通道关闭的速率，，，，，，在一连光照刺激下镌汰失活率。 。。。 。
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ChR2(C128S/D156A)：ChR2的突变体，，，，，，SFO光敏通道，，，，，，用470nm激活通道，，，，，，然后用590nm激光关闭通道，，，，，，可以翻开其离子通道长达30分钟。 。。。 。
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C1V1：540nm-560 nm引发。 。。。 。红移视卵白，，，，，，该通道卵白类型更利于双光子引发。 。。。 。
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Chronos：500-530nm引发。 。。。 。高光敏度及快速开关动力学。 。。。 。
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ChrimsonR：590-600nm引发。 。。。 。做了K176R的点突变，，，，，，增添了通道的关闭速率，，，，，，适适用于刺激频率较高的场合。 。。。 。
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ST-ChroME：530nm左右引发，，，，，，胞体定位，，，，，，激活型ChroME通道。 。。。 。
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ChRger：470nm蓝光引发。 。。。 。相对无创（光纤安排在颅骨外貌）。 。。。 。
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几种抑制神经元运动的通道卵白
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eNpHR3.0：589nm黄光引发。 。。。 。第一个有用抑制神经元运动的光遗传学工具，，，，，，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，，，，，，而抑制神经元运动。 。。。 。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，，，，，，会群集在内质网上，，，，，，因此，，，，，，将内质网输出元件、高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在NpHR基因序列后面，，，，，，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量群集，，，，，，修悔改的NpHR被称为eNpHR3.0，，，，，，因此，，，，，，eNpHR3.0 对细胞膜的靶向性较好，，，，，，电流较为长期，，，，，，响应时间短，，，，，，反应迅速。 。。。 。
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Arch：566nm左右引发。 。。。 。即为archaerhodopsin，，，，，，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，，，，，，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外情形中，，，，，，使神经元处于超极化状态。 。。。 。在特定条件下，，，，，，可用于增添细胞内pH或镌汰细胞外基质pH。 。。。 。和NpHR相比，，，，，，当激光关闭的时间，，，，，，Arch连忙从通道翻开状态恢复到关闭状态。 。。。 。
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Mac：540nm引发。 。。。 。即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，，，，，，是一种能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外情形中的质子泵，，，，，，使神经元处于超极化状态。 。。。 。
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Jaws：632nm引发，，，，，，红移视卵白，，，，，，红光照射下会使氯离子内流，，，，，，从而抑制神经元运动。 。。。 。
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ST-eGtACR1：515nm引发。 。。。 。GtACR是一个Cl-通道，，，，，，效率比NpHR、Arch等离子泵高许多，，，，，，快速抑制。 。。。 。适合照光时间特殊短、行为效应特殊短的情形。 。。。 。ST-eGtACR1为其胞体定位版本。 。。。 。
常见光敏感通道特征（Karl Deisseroth’s, Nat Methods,2012）
光遗传学手艺的应用战略
借助病毒载体的光遗传学手艺应用一样平常包括以下几个要害办法：
1、 凭证实验需求寻找合适的光敏卵白；； ；；；
2、通过病毒载体熏染细胞，，，，，，将光敏感通道表达在靶细胞中；； ；；；
3、手术手段向脑中导入光纤，，，，，，通过控制激光来实现对神经元运动的精准控制；； ；；；
4、选择合适的病毒表达时间，，，，，，连系行为实验设置合理的试验计划；； ；；；
5、行为学手段或电心理手段验证。 。。。 。
光遗传学手艺的一样平常战略（Karl Deisseroth, Scientific American, 2010）
光遗传学手艺在啮齿类动物中的应用案例
Yan-Gang Sun’s lab. Science 2017[1]
注射部位：小鼠脊髓
载体：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry& AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.1× 1012 VG/mL&1.7× 1013 VG/mL
注射体积：400-600nl
Zhong Chen’s lab. Nat Commun, 2020[2]
注射部位：PV-Cre小鼠的SNr区
载体：PV-Cre: AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry & AAV-CAG-FLEX-ArchT-GFP
病毒滴度：1.7× 1013 VG/mL&1.3× 1012 VG/mL
注射体积：200nl
光遗传学非人灵长类（NHP）实验数据资源库
光遗传学手艺的出来可以资助科研职员更深入的明确大脑与行为之间的神经机制，，，，，，现在关于光遗传学的应用主要集中在啮齿类小动物模子，，，，，，为了最大限度的施展光遗传学的潜力，，，，，，使其成为研究人类认知和行为的主要工具，，，，，，然而，，，，，，在这项手艺应用于人类之前，，，，，，审慎的做法是先在非人类灵长类动物(non-human primates, NHPs)身上证实其清静性和有用性。 。。。 。NHPs的剖解学、心理学、遗传学和行为学特征比任何其他动物模子更靠近人类。 。。。 。NHP与人类之间的同源性使其成为明确人类大脑功效和障碍的最佳实验模子。 。。。 。使用光遗传学从NHPs的细胞水平、环路水平及大脑网络层面去剖析神经机制，，，，，，有望展现人类大脑功效和障碍的基本机制。 。。。 。
然而，，，，，，在非人灵长类动物上使用光遗传学保存不少手艺障碍，，，，，，好比关于病毒载体、启动子和视卵白的选择，，，，，，以及注射剂量等等。 。。。 。由于啮齿动物和NHP之间的剖解学和遗传学差别，，，，，，意味着那些在啮齿动物中使用的光遗传学战略在NHP中并不总是有用，，，，，，关于想要开展NHPs光遗传学实验的研究职员来说，，，，，，实验的操作指南很少。 。。。 。
使用光遗传学手艺揭晓的文章数
基于此，，，，，，2020年10月19日宾夕法尼亚大学Sébastien Tremblay在《Neuron》在线揭晓题为An Open Resource for Non-human Primate Optogenetics的文章[3]，，，，，，综述了光遗传在非人灵长类动物模子中的最新希望，，，，，，该文章总结了天下各地45个实验室，，，，，，1000多个注射实验的要领和效果（包括未揭晓的数据），，，，，，整合成光遗传学非人灵长类动物实验数据资源库，，，，，，以资助扩大光遗传学在NHPs中的应用。 。。。 。
该数据库包括6种差别品系的NHP，，，，，，其中大部分实验在恒河猴（71%）上举行；； ；；；使用最多的病毒载体为AAV2/5型（36%），，，，，，其次是AAV2/9型（13%）；； ；；；使用最普遍的启动子为CaMKIIa（37%，，，，，，特异性标记投射神经元），，，，，，其次为hSyn（22%，，，，，，特异性标记成熟神经元）和CAG（11%，，，，，，广谱表达启动子）。 。。。 。 别的，，，，，，在NHP中应用最普遍的报告基由于EYFP（45%），，，，，，其次为GFP（17%）和mCherry（13%）。 。。。 。
同时，，，，，，该数据库还剖析了在NHP中最常用的到光遗传视卵白：约39%使用激活型视卵白--hChR2(H134R)、约25%使用抑制型视卵白，，，，，，这其中包括6%的ArchT、6%的Jaws。 。。。 。
随后，，，，，，研究职员通过剖解学、心理学、行为学手段来评估光遗传学实验在NHPs中的乐成率：
发明，，，，，，在食蟹猴（88%）的乐成率最高，，，，，，而AAV2/9和AAV2/8M(Y733F) 的乐成率最高，，，，，，划分为93%和88%，，，，，，别的，，，，，，对启动子剖析发明，，，，，，用CMV和CaMKIIa举行NHPs光遗传学实验的乐成率最高，，，，，，划分为85%和84%。 。。。 。
在视卵白方面，，，，，，eNpHR3.0的乐成率最高，，，，，，为88%；； ；；；C1V1(T/T)，，，，，，其乐成率约为86%，，，，，，hChR2(H134R)，，，，，，在397次的注射实验中，，，，，，爆发了85%的乐成率。 。。。 。
一样平常以为，，，，，，较慢的注射速率可以镌汰对脑组织的创伤，，，，，，别的，，，，，，由于NHPs脑相较于啮齿类动物脑更大更重大，，，，，，病毒载体的注射体积也会影响实验效果。 。。。 。
从该数据库中剖析了注射速率从6 nL/min到5000 nL/min的乐成实验，，，，，，大都集中在200 nL/min。 。。。 。注射体积大都为1-3uL。 。。。 。
光遗传学手艺优势
1、 时间准确度高：光遗传手艺可以通过控制激光使时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级；； ；；；
2、 刺激的强度准确性高：光遗传手艺通过控制激光，，，，，，可以精准地、随时地调理给神经元刺激的强度，，，，，，这关于某些刺激强度依赖的神经环路研究有不可替换的优势；； ；；；
3、 空间特异性：光遗传学手艺可以通过脑定位注射、特异性启动子、甚至是亚细胞器定位肽，，，，，，将光敏感卵白锚定在靶向细胞或细胞器举行操作，，，，，，可抵达单个细胞的级别，，，，，，实现精准定位；； ；；；
4、 作用工具多样：现在人们已经突变了一系列新的光敏感通道，，，，，，这些通道的时间特征和引发光要求都差别，，，，，，可凭证详细的实验需求举行选择；； ；；；
5、 作用直接：不像DREADDs手艺依赖于动物代谢水平，，，，，，光遗传学手艺通过激光操控细胞的激活或抑制，，，，，，作用直接。 。。。 。
参考文献
[1] Science. 2017 Aug 18;357(6352):695-699. doi: 10.1126/science.aaf4918.
[2] Nat Commun. 2020 Feb 17;11(1):923. doi: 10.1038/s41467-020-14648-8.
[3] Neuron. 2020 Oct 12;S0896-6273(20)30751-0. doi: 10.1016/j.neuron.2020.09.027.
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