慢病毒系列｜收下这篇集锦，，，轻松拿捏慢病毒
?就要做慢病毒实验了，，，却无从下手？？？？
实验前都要做哪些准备呢？？？？
什么是MOI？？？？选个什么样的细胞呀？？？？怎样提高病毒熏染效率？？？？
为什么慢病毒熏染后细胞状态变差？？？？荧光不亮又是怎么回事呢？？？？
……
知己知彼才华战胜我们遇到的问题，，，追随小编来相识一下今天的主角——慢病毒。。。 。。
UG环球生物●慢病毒的清静性
UG环球生物提供慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础经由人工构建的重组慢病毒，，，不会使用宿主细胞爆发新的病毒颗粒再去熏染其他细胞，，，且病毒中的毒性基因已被外源性目的基因所取代，，，属于假型病毒。。。 。。操作上相对清静，，，但在使用历程中仍需要遵守清静使用规范：
实验前：规范衣着及佩带实验服、手套、口罩和帽子；；；；；
实验中：在BSL-2实验室的生物清静柜中操作，，，阻止对病毒举行操作时爆发飞溅；；；；；
实验后：接触过病毒的耗材需加入84消毒液（10:1）浸泡24h后处置惩罚，，，相关的放弃物需要网络统一灭菌，，，用胰子洗濯双手；；；；；
※若不小心接触到皮肤，，，别慌！请连忙用大宗水冲洗5min，，，皮肤裸露处可使用酒精喷一下，，，若有不适请实时就医。。。 。。
UG环球生物●慢病毒的包装及侵染细胞的机制
UG环球生物的慢病毒包装接纳三质粒或是四质粒系统举行包装，，，将包装质粒、包膜质粒以及穿梭质粒配合转染至293T细胞中，，，通详尽胞的作育上清液纯化病毒。。。 。。慢病毒通过膜融合或内吞的方法进入细胞释放RNA，，，在逆转录酶、整合酶等的作用形成DNA整合前复合体进入细胞核并随机整合到宿主细胞的基因组中，，，随后最先转录翻译(如图1)。。。 。。
知心tips：怎样提高病毒滴度？？？？
1. 293T细胞处于对数生恒久；；；；；
2. 质粒浓度大于1mg/mL，，，且无卵白、核酸等污染；；；；；
3. 于转染后48h和72h两次收毒，，，提高病毒的量；；；；；
4. UG环球生物针对编码基因，，，非编码基因导致的出毒异常，，，专门开发了已授权的专利——Vpack慢病毒包装系统，，，解决病毒不出毒, 滴度低的问题。。。 。。
UG环球生物●慢病毒的滴度检测
滴度：即单位体积中有熏染能力的病毒数目，，，单位TU/mL，，，是活性滴度单位，，，主要是指能够熏染并进入细胞中的病毒基因组数目。。。 。。
常用的滴度检测要领有：
1. 通过酶联免疫吸附测定法对病毒颗粒中的P24卵白举行检测；；；；；
2. 定量PCR对病毒颗粒的RNA拷贝数举行检测；；；；；
（1和2两种快速检测要领未思量到病毒活性，，，因此是禁绝确的）
3. 定量PCR对整合到基因组DNA中的病毒拷贝数举行检测，，，可以准确知道转到细胞的病毒颗粒浓度（UG环球生物病毒滴度的检测要领）
UG环球生物●提孤高病毒的熏染效率
1. 包管细胞状态优异，，，正常增殖，，，轮廓清晰；；；；；
2. 确定合适的MOI：可查阅文献，，，获得目的细胞参考MOI，，，或举行MOI梯度探索预实验，，，设置0/10/20/40/80差别的MOI梯度，，，在72h后选取熏染效率抵达80%左右且细胞状态优异的最小MOI值（较低的MOI可以阻止细胞毒性的爆发）；；；；；
3. 选择助转剂polybrene，，，是一种阳离子聚合物，，，可中和界面电荷增进病毒与细胞膜连系，，，有用提高10-30%的熏染效率；；；；；
4. 若是熏染悬浮细胞，，，镌汰病毒熏染时的体积，，，可提高熏染效率。。。 。。将细胞培板用封口膜密封，，，水平转子低速离心（＜1200g）1h，，，放回作育箱继续作育；；；；；
5. 若是极难熏染的细胞可接纳重复熏染增添熏染效率（注重重复熏染间细胞的状态）。。。 。。
※病毒量盘算要领：病毒加样量（μL）=（细胞数×MOI/病毒原液滴度）×103
UG环球生物●慢病毒的使用与生涯
慢病毒通常接纳干冰运输，，，若在收到货后3d内使用完，，，病毒可在4℃短期生涯，，，若恒久生涯需置于-80℃生涯。。。 。。注重稀释病毒前，，，病毒需在冰上融化，，，用PBS或是作育基稀释到响应的浓度，，，且阻止重复冻融降低病毒活性，，，可举行适当体积的分装。。。 。。
当你在做慢病毒实验时，，，可能会遇到许多问题，，，但有许多共性问题是大部分科研人都会遇到的，，，小编今天就总结了一些经常遇到的问题以及解决步伐，，，一起来看看吧。。。 。。
UG环球生物●慢病毒常见问题
01 什么是MOI？？？？
答：MOI，，，熏染复数，，，界说为熏染时病毒和细胞数目的比值，，，即平均每个细胞熏染的病毒活性单位数。。。 。。也会反应出病毒对细胞的熏染能力，，，MOI越高，，，细胞越难被熏染。。。 。。在实验中细胞熏染率抵达80%的MOI界说为这种细胞的最适MOI。。。 。。
02 慢病毒熏染细胞后，，，目的基因或滋扰序列的表达是瞬时表达照旧稳固表达？？？？
答：由于慢病毒具有整合外源序列至宿主基因组中的能力，，，因别的源序列是稳固表达，，，并随细胞的增殖分解一起复制并遗传到子细胞中。。。 。。
03 慢病毒载体可以作为通例的过表达质粒举行使用吗？？？？
答：可以，，，但慢病毒载体骨架较大，，，整个质粒较通俗真核载体大，，，会影响转染效率。。。 。。
04 病毒熏染细胞后为何状态会变差？？？？
答：
1. 病毒熏染换液时间不宜凌驾24h；；；；；
2. 外源表达基因与生运气动有关，，，影响细胞状态；；；；；
3. 敏感细胞，，，MOI过高会对细胞造成危险。。。 。。
05 过表达质粒/病毒，，，为什么目的抗体检测会泛起两条带？？？？
答：
1. 标签具有一定巨细，，，外源表达的卵白要比内源卵白大一些；；；；；
2. 外源表达的卵白与内源卵白表达后的修饰有所差别，，，导致卵白条带巨细纷歧致；；；；；
3. 目的抗体特异性较差，，，检测到差别的异构体。。。 。？？？？墒笛楸昵┛固寰傩屑觳。。。 。。
06 慢病毒熏染细胞后基因表达何时抵达峰值？？？？
答：一样平常的细胞在慢病毒熏染72h左右GFP或外源序列的表达会抵达峰值，，，生长缓慢的细胞抵达峰值的时间会延伸。。。 。。
07 过表达病毒熏染后，，，为什么目的抗体检测不到过表达效果？？？？
答：在包管慢病毒熏染效率的条件下，，，可能保存以下缘故原由：
1. 细胞目的基因内源表达水平太高会影响外源基因的表达，，，可通过qPCR检测本底表达，，，选择低表达的细胞系；；；；；
2. 目的基因与细胞生长增殖等相关性较高，，，过表达会影响细胞状态、生长、增殖等，，，细胞自身调控作用会抑制目的基因的过表达效果；；；；；
3. 目的抗体迅速度或特异性不敷，，，可实验标签抗体举行检测，，，检测效果均为外源过表达的卵白。。。 。。
08 滋扰慢病毒熏染后，，，为什么目的抗体检测不到滋扰效果？？？？
答：在包管慢病毒熏染效率的条件下，，，可能保存以下缘故原由：
1. 细胞目的基因内源表达水平太低，，，很难通过敲减手段使其表达更低，，，可通过qPCR检测本底表达，，，选择高表达的细胞系；；；；；
2. 目的基因与细胞生长增殖等相关性较高，，，敲减会影响细胞状态、生长、增殖等，，，细胞自身调控作用会抑制目的基因的敲减效果；；；；；
3. 体内敲减在取材时无法包管只取特异性组织或细胞举行滋扰检测，，，可用原位杂交或是免疫荧光等方法检测；；；；；
4. 目的抗体迅速度或特异性不敷，，，可实验用qPCR的要领检测。。。 。。
09 滋扰慢病毒熏染细胞的MOI是否可直接应用于过表达慢病毒实验？？？？
答：针对统一家公司的病毒，，，可以参考原来的MOI值，，，敏感细胞可思量在原MOI值的基础上，，，上下选择1-2个梯度举行MOI探索；；；；；若是差别公司的病毒建议重新举行MOI梯度探索预实验。。。 。。
10 为什么慢病毒熏染后的荧光较弱？？？？
答：荧光卵白的表达与启动子、表达方法、毗连元件等有关
1. 如CMV等强启动子会使荧光表达较强；；；；；
2. 融合表达可能会导致荧光卵白的过失折叠造成检测不到荧光信号或信号较弱；；；；；
3. 当过表达基因在荧光卵白上游时，，，过表达的基因片断过长或高GC片断会降低下游荧光卵白的强度，，，较比照组的荧光弱；；；；；
4. 非融合表达时IRES毗连元件下游荧光卵白显着弱于上游的目的基因的表达。。。 。。
11 慢病毒熏染细胞后2-3周，，，为什么荧光或过表达（滋扰）效果没有最先熏染时好？？？？
答：随着细胞传代，，，细胞内部的调控机制会使外源序列表达趋于稳固，，，因此，，，较熏染最初的瞬时效果可能会泛起荧光或过表达（滋扰）效果削弱的征象。。。 。。
12 是否可以在统一稳固株中同时过表达或滋扰两个基因？？？？
答：可以，，，细胞可遭受条件下，，，可将两个基因（靶点）构建到统一载体上或划分构建到两个载体上，，，并且两个载体的真核抗性差别。。。 。。
……
没有找到你遇到的问题的解决步伐？？？？没关系，，，更多问题可在留言板中留言或是后台联系小编与你一起解决。。。 。。也接待各人踊跃留下在使用慢病毒时困扰着你的问题。。。 。。
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