Nat Commun | JAK抑制剂或可解决玄色素瘤免疫疗法耐药问题
?前言
2022年8月，，阿拉巴马大学伯明翰分校Lewis Shi团队在Nature Communications揭晓“Selective suppression of melanoma lacking IFN-γ pathway by JAK inhibition depends on T cells and host TNF signaling”，，该研究使用IFNγR1敲除的玄色素瘤细胞，，构建免疫检查点阻断剂（immune checkpoint blocker, ICB）耐药小鼠模子，，发明ICB耐药的潜在靶点JAK1/2，，其抑制剂以T细胞和肿瘤坏死因子依赖的方法选择性抑制IFN-γ信号缺失的玄色素瘤。 。。
配景先容
ICB是恶性肿瘤治疗领域的重大突破，，尤其是在玄色素瘤中。 。。肿瘤细胞会通过控制免疫检查点卵白，，如CTLA-4、PD-1、PD-L1等，，来逃阻止疫监视。 。。ICB则通过阻断免疫检查点，，在肿瘤浸润T细胞（tumor-infiltrating T cell, TIL）中增强免疫效应功效，，并且降低免疫抑制的FoxP3+调理性T细胞（Treg）的品貌，，从而实现对肿瘤的抑制。 。。
只管云云，，仍有许多患者对ICB治疗耐受，，其中一个主要缘故原由是肿瘤细胞IFN-γ信号缺失，，现在尚缺乏针对ICB耐药的治疗战略。 。。肿瘤内IFN-γ信号在ICB抗肿瘤功效中是必需的，，但在作者的前期研究中，，对玄色素瘤敲低IFNγR1（IFNγR1KD）却并没有显着改变TIL中CD8+/Treg比例，，这可能由于细胞中仍有剩余的IFN-γ信号。 。。作者思量使用CRISPR手艺对IFNγR1举行敲除，，进而探讨战胜ICB耐药的潜在靶点。 。。
研究思绪
01 构建IFNγR1敲除的玄色素瘤细胞系，，以及移植瘤小鼠模子，，验证模子能够有用模拟IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药。 。。
02 从肿瘤免疫微情形剖析ICB耐药，，检测IFN-γ信号缺失对TIL的影响，，发明IFN-γ信号缺失使肿瘤内T细胞特征镌汰。 。。
03 使用激酶组剖析寻找可能的ICB耐药靶点，，发明IFN-γ信号缺失的玄色素瘤细胞中JAK1/2激酶通路的激活。 。。
04 划分从胞外和胞内探讨JAK1/2通路激活的因素，，找到PI3K-Akt和mTOR信号通路，，通过差别抑制剂处置惩罚等证实mTOR在上游调控JAK1/2通路。 。。
05 体内验证JAK1/2抑制剂可以通过T细胞和TNF因子依赖的方法特异性阻碍IFN-γ信号缺失的玄色素瘤生长。 。。
研究内容
首先，，作者使用CRISPR-Cas9手艺在B16细胞中敲除IFNγR1（IFNγR1KO），，并接种至BL6小鼠中构建玄色素瘤小鼠模子。 。。履历证IFNγR1KO细胞对IFN-γ的刺激没有响应，，体现为JAK2磷酸化、Irf1、PD-L1、MHC-I/II等在IFN-γ刺激下均没有上调，，别的IFN-γ也不可诱导IFNγR1KO细胞凋亡或抑制其细胞增殖。 。。IFNγR1的敲除自己对B16细胞体内成瘤能力没有影响，，但IFNγR1KO玄色素瘤对CTLA-4抗体的处置惩罚耐受。 。。与体外数据一致，，体内IFNγR1KO玄色素瘤经CTLA-4抗体治疗后，，PD-L1和MHC-II等表达也没有上调。 。。
接下来作者剖析IFNγR1KO玄色素瘤中的TIL表型。 。。流式发明CD8+ T细胞的基数镌汰，，并且CTLA-4抗体治疗不会像比照玄色素瘤那样，，增添T细胞浸润、镌汰瘤内Treg细胞比例、或增进效应细胞因子渗透等等。 。。对TCGA数据库中玄色素瘤举行剖析，，凭证IFNGR1表达量分为两组，，发明IFNGR1低表达的玄色素瘤中T细胞特征基因表达降低，，包括T细胞外貌标记物、效应分子和MHC分子等，，同时IFNGR1低表达的玄色素瘤患者生涯率也显著降低。 。。相比于皮肤玄色素瘤（SKCM），，葡萄膜玄色素瘤（UVM）对免疫磨练点抑制剂（ICB）越发耐受，，数据库批注UVM中IFNGR1表达，，以及T细胞特征基因表达更低。 。。
思量到酪氨酸激酶在IFN-γ信号中的主要作用，，作者对IFNγR1KO细胞举行了激酶组活性剖析，，试图在其中寻找战胜ICB耐药的靶点。 。。这一剖析发明激活的激酶网络搜集到JAK1/2，，WB验证IFNγR1KO细胞JAK1/2及其下游STAT3的磷酸化水平升高，，而在IFNγR1KO细胞重新表达Ifngr1后，，JAK1/2磷酸化水平回调，，说明玄色素瘤中IFN-γ信号的缺失与JAK1/2异常激活保存联系。 。。
JAK-STAT通路可能由胞外信号如IFN-γ、IFN-α/β、IL-6等激活。 。。Il6、Il6r以及IFNαR1（IFN-α/β受体）在IFNγR1KO细胞中表达升高，，但IL-6和IL-6R抗体处置惩罚，，或敲除Ifnar1均不可使IFNγR1KO细胞的JAK1/2磷酸化水平降低，，说明不是这些因素使JAK1/2激活。 。。进一步剖析其他胞外因素，，作者用IFNγR1KO细胞的作育基上清处置惩罚比照玄色素瘤细胞，，发明并不可诱导JAK2磷酸化水平上升，，因此IFNγR1KO细胞JAK1/2的激活更可能是胞内事务的效果。 。。
为了明确使JAK1/2的激活胞内因素，，作者对IFNγR1KO和比照细胞举行了全转录组测序，，使用差别表达基因举行通路富集剖析，，并且举行了磷酸化卵白质组学研究。 。。这些剖析均发明PI3K-Akt和mTOR信号通路的显著差别，，WB验证了IFNγR1KO细胞中AKT和4E-BP1（mTOR下游）磷酸化水平升高。 。。作者进一步研究JAK1/2与mTOR通路的关系。 。。mTOR抑制剂rapamycin (Rapa)处置惩罚IFNγR1KO细胞显著抑制JAK2磷酸化，，而JAK1/2抑制剂ruxolitinib (Ruxo)处置惩罚后4E-BP1磷酸化水平稳固，，并且在IFNγR1KO细胞中敲低mTOR也能使JAK1/2磷酸化回调。 。。因此，，在IFN-γ信号缺失的玄色素瘤细胞中，，mTOR通路信号增强，，并调控下游JAK1/2的激活。 。。
上述效果提醒IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药或允许以通过靶向mTOR-JAK1/2来解决，，作者随后在B6小鼠中举行体内验证。 。。在用Ruxo划分处置惩罚IFNγR1KO和比照玄色素瘤小鼠模子后，，发明Ruxo仅特异性抑制IFNγR1KO玄色素瘤生长。 。。只管云云，，体外实验批注这一抑制作用并非由Ruxo对IFNγR1KO细胞的直接杀伤所致。 。。对体内玄色素瘤的剖析显示，，Ruxo能够镌汰CD4+ TIL中Treg细胞比例，，增添TNF、IFN-γ、穿孔素、IL-2的渗透。 。。而从未经药物处置惩罚的玄色素瘤中疏散TIL举行体外作育，，发明Ruxo处置惩罚降低FoxP3表达，，增强TIL的效应功效。 。。以上效果批注Ruxo依赖于TIL施展对IFN-γ信号缺失的玄色素瘤的抑制作用，，而非直接杀伤肿瘤细胞。 。。
为了评估T细胞在Ruxo治疗中的作用，，作者对接受Ruxo治疗的IFNγR1KO玄色素瘤小鼠举行CD4或CD8中和抗体处置惩罚，，发明任一种T细胞的缺失都使Ruxo的治疗无效。 。。在对Ruxo抑癌效应机制的探讨中，，作者关注到TNF。 。。IFNγR1KO玄色素瘤细胞接种至TNF敲除（TNF-/-）小鼠后，，Ruxo不可将其抑制。 。。对TIL的剖析也发明，，TNF-/-小鼠中Ruxo处置惩罚不可使Treg细胞比例下降，，或使IFN-γ、IL-2等因子渗透增添。 。。因此，，Ruxo对IFNγR1KO玄色素瘤的特异性抑制依赖于T细胞和TNF因子。 。。
综上所述，，文章使用IFNγR1敲除的玄色素瘤小鼠模子，，发明IFN-γ信号缺失的玄色素瘤免疫微情形更倒运于抑制肿瘤；；；；；连系激酶组、转录组、磷酸化卵白质组等多组学剖析，，发明此类玄色素瘤中mTOR通路信号增强，，从而激活下游JAK1/2激酶；；；；；JAK或允许以作为IFN-γ信号缺失所致ICB耐药的靶点，，对临床有一定的指导意义。 。。
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