癌细胞还能这样杀？ ？？？！“i-CRISPR”战略——打断癌细胞特有的DNA，，，，却阻止其修复
?现在，，，，手术、化疗和放疗是治疗癌症的主要方法，，，，因个体化的差别导致很大一部分患者不可完全治愈[1,2]。。。。。。仅通过手术通常无法扫除所有的癌细胞，，，，而其他放疗、化疗等战略在杀死癌细胞的同时，，，，往往会对正常组织造成严重的损害[3,4]。。。。。。因此，，，，开发一种既能特异性杀伤癌细胞又不会对正常细胞造成显着损伤的战略，，，，对癌症治疗具有主要的临床意义。。。。。。
不可修复的DNA损伤会导致细胞殒命，，，，癌症的放射治疗正是使用了该原理，，，，通过电离辐射对细胞诱导不可修复的DNA损伤，，，，不过放疗造成的DNA双链断裂(DSBs)是随机的，，，，不具有特异性，，，，难以阻止对正常细胞的损伤[5,6]。。。。。。
随着科学手艺的一直生长，，，，新兴的CRISPR-Cas9基因编辑手艺可以实现在特定位点精准建设DSBs[7-9]。。。。。。在高等真核生物中，，，，DSBs会通过非同源最后毗连(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组(homologous recombination, HR)修复途径对其举行修复[10,11]。。。。。。若是在抑制上述DNA修复通路的同时，，，，使用CRISPR-Cas9基因编辑手艺仅对癌细胞特有的DNA举行精准切割，，，，是否就能特异杀伤癌细胞了呢？ ？？？这是水师军医大学的研究者们创立性地提出的一个癌细胞特异性杀伤的构想。。。。。。并且该构想被实验证实，，，，相关效果近期以“i-CRISPR：a personalized cancer therapy strategy through cutting cancer-specific mutations”为题，，，，在线揭晓在国际权威期刊Molecular Cancer (IF=41.444) 上。。。。。。水师军医大学王越，，，，杨彦勇，，，，高福，，，，韩超峰教授为文章的配合通讯作者，，，，蒋俊锋，，，，陈媛媛和张莉为本文的并列第一作者。。。。。。
研究提出的“i-CRISPR”战略，，，，就是凭证癌细胞的DNA序列，，，，定制且导入仅能切割癌细胞DNA的CRISPR-Cas9系统——“癌细胞CRISPR铰剪”，，，，造成癌细胞中DNA断裂 ；；；；；同时添加DNA损伤修复抑制剂(DNA damage repair inhibitor, DSBRi)，，，，使癌细胞中止裂的DNA无法修复，，，，导致细胞殒命。。。。。。DNA损伤修复抑制剂就是“i-CIRSPR”战略中的“i”，，，，切割癌细胞DNA的“癌细胞CRISPR铰剪”就是“i-CIRSPR”战略中的“CRISPR”。。。。。。 由于正常细胞中不含有可被“癌细胞CRISPR铰剪”切割的位点，，，，因此其DNA不会被切割，，，，便不会受到严重损伤。。。。。。云云，，，，这种“i-CRISPR”战略有望实现既能特异性杀伤癌细胞又不会对正常细胞造成显着损伤的效果，，，，该战略为肿瘤的精准治疗提供了新的治疗思绪。。。。。。
效果
01“i-CRISPR”个性化癌症治疗战略的设计流程
Step 1
对患者的肿瘤样本举行DNA测序，，，，癌细胞与正常细胞较量筛选奇异的DNA突变位点。。。。。。
Step 2
设计特异性靶向癌细胞DNA突变位点的gRNA 用于开发CRISPR-Cas9基因编辑系统。。。。。。
Step 3
导入CRISPR-Cas9基因编辑系统，，，，同时加入DSBRi于细胞中，，，，实现对癌细胞的特异性杀伤（图1）。。。。。。
图1. “i-CRISPR”个性化癌症治疗战略流程图
02“i - CRISPR”战略通过诱导响应突变位点的DSBs杀死癌细胞
为了验证“i - CRISPR”战略，，，，研究者首先通过全基因组测序剖析了人肝癌细胞系HepG2的DNA序列，，，，从1000多个潜在位点选取了8个候选靶点并设计响应的gRNA-Cas9，，，，通过腺病毒载体导入HepG2细胞。。。。。。体外实验验证了在CRISPR基因编辑系统导入后，，，，HepG2细胞的编辑位点爆发了DSBs事务，，，，且DSBs标记物γH2AX表达显著上升，，，，然而经由相同处置惩罚的Huh7细胞（无CRISPR基因编辑靶点）有较少的DSBs事务爆发。。。。。。
为了增进DSBs诱导的细胞殒命，，，，研究职员使用靶向NHEJ（DNA-PKcs抑制剂NU7441）和HR（ATM抑制剂KU55933）修复的抑制剂[12,13]处置惩罚细胞，，，，DSBs修复被显著抑制，，，，且 NU7441 + Ku55933联合处置惩罚HepG2细胞中视察到更多未被修复的DSBs。。。。。。别的，，，，该战略接纳gRNA-Cas9慢病毒系统导入前线腺癌细胞系DU145中，，，，在替换了DNA损伤修复的抑制剂后也同样获得了增进细胞凋亡的效果，，，，且不具有耐药性。。。。。。但对正常293T细胞（无CRISPR基因编辑靶点）的活力无抑制作用。。。。。。
随后，，，，作者建设的类器官模子和人源肿瘤组织异种移植模子 (PDX)研究证实 “i - CRISPR”战略有用抑制肿瘤生长，，，，小鼠体重、血生化以及血通例等数据也能够证实该战略具有优异的生物清静性（图2）。。。。。。体内外实验效果证实，，，，使用CRISPR手艺对突变位点特异性基因编辑并连系DNA修复抑制剂可显著抑制肿瘤生长，，，，该战略在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。。。。。。
图2. “i-CRISPR”战略特异有用杀伤癌细胞
03“i - CRISPR”战略杀伤细胞的分子机制
研究者使用串联质谱对3组HepG2细胞举行定量磷酸化卵白质组学剖析来探索“i - CRISPR”战略对肿瘤细胞的杀伤机制。。。。。。效果显示，，，，在C-Cut组和NC组之间保存少量差别磷酸化卵白，，，，而在C-Cut-2i组中具有奇异且差别较大的磷酸化卵白主要位于细胞核中。。。。。。GO剖析效果显示，，，，C-Cut组中改变的DNA损伤相关磷酸化卵白水平增添并富集在染色质组织和DNA损伤相关通路 ；；；；；C-Cut-2i组的差别磷酸化卵白富集在自噬、铁殒命、凋亡、坏死性凋亡等种种细胞殒命相关通路，，，，尤其是自噬。。。。。。因此，，，，作者以为自噬的激活在增添C-CUT-2i组细胞殒命的分子机制中施展了要害作用。。。。。。
通过全基因组甲基化测序(WGBS)效果证实gRNA-Cas9和DSBRis战略并没有显着改变细胞系中DNA甲基化相关的表观遗传调控。。。。。。但相较于比照细胞却保存一些差别甲基化区域(DMRs)，，，，且DMRs定位基因富集在细胞殒命、程序性细胞殒命和染色体组织以及凋亡通路中。。。。。。
癌症治疗面临的另一个难题是一直突变的癌细胞的进化。。。。。。研究者对DU145的三个单克隆株A6（作育约60代）、B12和B13（作育约80代）划分举行全基因组测序，，，，发明单克隆株在进化历程中爆发新的突变，，，，泛起异质性。。。。。。但仅有少部分是其特有的(A6: 17.11%;B12: 32.10%;B13: 38.72%)，，，，大大都原始突变得以保存。。。。。。别的，，，，本研究的DU145数据与果真的DU145突变数据举行比照也证实凌驾一半的原始突变仍然保存（图3）。。。。。。
图3. “i-CRISPR”战略杀伤细胞的分子机制
结论
研究批注：“i - CRISPR”战略可以实现对癌细胞的特异性杀伤，，，，而对正常细胞不造成显着损伤，，，，并且，，，，该战略在解决目今癌症治疗所面临的癌症进化问题上也有很大的优势。。。。。。随着测序和克隆进化剖析等生物信息学手艺的生长，，，，将从患者身上识别出所有癌细胞普遍保存的原始突变基因，，，，解决癌症异质性带来的问题。。。。。。通过CRISPR基因编辑舷连系DNA损伤修复抑制剂诱导肿瘤细胞特异性DSBs，，，，加速细胞殒命，，，，可作为肿瘤精准治疗的一种新战略，，，，为个体化肿瘤治疗提供新思绪。。。。。。
参考文献：
1. Giordano SH, Elias AD, Gradishar WJ. NCCN guidelines updates: breast cancer. J Natl Compr Cancer Netw. 2018;16:605–10.
2. Noy BM, Rich BJ, Llorente R, Kwon D, Abramowitz M, Mahal B, et al. Levels of evidence for radiation therapy recommendations in the National Comprehensive Cancer Network (NCCN) clinical guidelines; 2021.
3. Nardon C. Anti-cancer chemotherapeutics in target therapy: from advanced preclinical studies on promising au(III) peptidomimetics toward the design of new receptor-recognizable metal-based agents; 2013.
4. Chang J, Mehran R, Feng L, Verma V, Liao Z, Welsh J, et al. Stereotactic ablative radiotherapy for operable stage I non-small-cell lung cancer (revised STARS): long-term results of a single-arm, prospective trial with prespecified comparison to surgery. Lancet Oncol.2021;22(10):1448–57.
5. Lord C, Ashworth A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 2012;481:287–94.
6. Olivieri M, Cho T, Álvarez-Quilón A, Li K, Schellenberg M, Zimmermann M, et al. A genetic map of the response to DNA damage in human cells. Cell. 2020;182:481–496.e421.
7. Jiang J, Zhang L, Zhou X, Chen X, Huang G, Li F, et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Sci Rep. 2016;6:21918.
8. Bailey S, Maus M. Gene editing for immune cell therapies. Nat Biotechnol. 2019;37:1425–34.
9. Frangoul H, Altshuler D, Cappellini M, Chen Y, Domm J, Eustace B, et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. N Engl J Med. 2021;384:252–60.
10. Becker J, Clifford G, Bonnet C, Groth A, Wilson M, Chapman J. BARD1 reads H2A lysine 15 ubiquitination to direct homologous recombination. Nature.2021;596(7872):433–7.
11. Scully R, Panday A, Elango R, Willis N. DNA double-strand break repairpathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol.2019;20:698–714.
12. Canny M, Moatti N, Wan L, Fradet-Turcotte A, Krasner D, Mateos-Gomez P, et al. Inhibition of 53BP1 favors homology-dependent DNA repair and increases CRISPR-Cas9 genome-editing efficiency. Nat Biotechnol. 2018;36:95–102.
13. Sultana R, Abdel-Fatah T, Abbotts R, Hawkes C, Albarakati N, Seedhouse C, et al. Targeting XRCC1 deficiency in breast cancer for personalized therapy. Cancer Res. 2013;73:1621–34.
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