滴度、空壳率、内毒素 | 您的rAAV载体能知足实验需求么 ？？？？？？
rAAV滴度
在基础科研、临床前研究和临床研究中，，， ，，rAAV载体的剂量一直是影响科研数据和基因治疗效果的主要因素，，， ，，rAAV基因组拷贝准确病毒滴定（即病毒滴度）也是rAAV载体质控的主要组成之一。。。rAAV滴度通常是通过丈量衣壳卵白或rAAV基因组来确定的。。。
已往几年泛起的几起rAAV基因疗法致死事务，，， ，，均与接受高剂量rAAV有关，，， ，，因此在现实研究或临床治疗中并非rAAV的剂量越高，，， ，，效果就越好。。。研究报道，，， ，，过高剂量的rAAV，，， ，，随着衣壳剂量的增添，，， ，，使得对衣壳特异性T细胞活化，，， ，，诱导免疫反应从而扫除转导的靶细胞，，， ，，导致治疗效果损失，，， ，，甚至由于严重的免疫反应导致殒命。。。低剂量的rAAV有可能被anti-AAV抗体，，， ，，甚至低滴度的中和抗体中和，，， ，，从而导致效果不显着。。。因此准确的rAAV滴度测定、合适的载体剂量规模区间，，， ，，是包管使用最佳效果的主要条件。。。
图1 载体剂量与系统载体转染后效果之间的关系
（Mingozzi et al., 2013）
rAAV空壳率
rAAV载体的纯度要求和杂质控制是载体制备、纯化、质控历程中的主要因素，，， ，，是顺遂开展临床前实验和临床研究的先决条件。。。在rAAV载体制备历程中，，， ，，除了含有全长DNA基因组的完整rAAV载体外，，， ，，有一定比例的rAAV颗粒不含任何DNA基因组，，， ，，被称为空病毒颗粒。。。
大宗空病毒颗粒的保存可能会影响rAAV载体的有用性和清静性，，， ，，它们可能作为抗原的供应源，，， ，，引起细胞免疫毒性；；；；；；亦有可能竞争细胞外貌受体连系位点，，， ，，影响转录效率。。。因此优化生产工艺，，， ，，探索控制空壳rAAV爆发的步伐；；；；；；建设有用纯化方法，，， ，，去除空壳rAAV是rAAV载体生产工艺主要使命，，， ，，关于获得可靠、稳固、有用的研究数据至关主要。。。
图2 UG环球生物rAAV载体生产空壳率
电镜效果：包装DNA基因组的病毒颗粒为实心颗粒（红色箭头）；；；；；；空病毒颗粒中心保存朴陋（黄色箭头）
rAAV内毒素
除空病毒颗粒等rAAV相关性杂质外，，， ，， rAAV生产历程中残留的内毒素也可能是导致宿主免疫反应的缘故原由之一。。。内毒素的释放主要是由细菌殒命自溶或粘附在其他细胞时造成的，，， ，，也会爆发在正常细胞生长和破碎历程中。。。因此，，， ，，在rAAV载体制备历程中，，， ，，无论是所需的质粒DNA、转染的293T细胞，，， ，，亦或是生产情形均有可能引入内毒素。。。
rAAV载体的内毒素可能会诱导宿主爆发免疫反应，，， ，，对细胞有较强的毒性作用，，， ，，也会导致机体发热，，， ，，引发全身性炎症反应，，， ，，最终导致殒命。。。因此，，， ，，无论是实验研究照旧临床应用，，， ，，都需要只管去除载体的内毒素。。。rAAV载体中内毒素的去除有一定的局限性，，， ，，本钱高且载体接纳率差，，， ，，因此从源头上控制内毒素的爆发尤为主要。。。
怎样获得高质量的rAAV载体
随着rAAV载体的基础研究和临床应用的一直生长，，， ，，使用高质量的rAAV载体可以为实验数据的稳固性和可靠性及临床治疗的清静性和有用性提供包管。。。
基于12年、30000+的病毒生产履历，，， ，，UG环球生物一连优化病毒生产全流程，，， ，，选择GMP级的质粒，，， ，，官方授权的293T细胞完成病毒包装。。。建设标准三级细胞库，，， ，，每月替换细胞，，， ，，包管代次；；；；；；优化质粒配比、病毒收获时间，，， ，，借助超离、PEG沉淀、超滤、层析等科研及工业生产中的整合纯化工艺，，， ，，一连降低rAAV载体的空病毒颗粒及内毒素残留，，， ，，经多次随机检测rAAV载体空壳率<2%、内毒素含量均＜2.5EU/mL，，， ，，远凌驾行业标准。。。同时，，， ，，对生产的每批rAAV产品在出库前均会举行物理滴度测定，，， ，，通过qPCR绝对定量的方法举行基因组拷贝数测定和考马斯亮蓝染色检测病毒衣壳卵白，，， ，，以包管产品的滴度准确。。。
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参考文献
[1] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013 Jul 4;122(1):23-36. doi: 10.1182/blood-2013-01-306647. Epub 2013 Apr 17. PMID: 23596044; PMCID: PMC3701904.
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