UG环球

双萤光素酶检测



双萤光素酶报告系统先容

双萤光素酶检测实验中的双萤光素酶包括两种，，，，，一种是作为报告基因的萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase简称F-Luc），，，，，另一种是作为内参的海肾萤光素酶（Renilla luciferase简称R-Luc），，，，，两种萤光素酶的底物和辅因子差别。
。。
。F-Luc需要萤光素、氧气、ATP、镁离子等，，，，，发光颜色黄绿色，，，，，波长550-570nm；；R-Luc仅需要腔肠素和氧气，，，，，波长480nm。
。。
。在细胞中同时表达F-Luc和R-Luc，，，，，F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，，，，，R-Luc作为内参基因，，，，，为试验提供一基准线（镌汰内在转变因素如作育细胞的数目，，，，，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。
。。
。所组成的报告系统普遍用于靶基因验证和启动子活性的研究。
。。
。





应用先容

靶基因验证
miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），，，，，将目的基因3’UTR（野生型和连系位点突变型）序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端，，，，，通过较量过表达miRNA后，，，，，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降照旧稳固），，，，，来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
。。
。



启动子活性研究
转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，，，，，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，，，，，通过共表达转录因子后，，，，，报告基因表达的改变，，，，，来确定转录因子与靶基因启动子连系位点及对靶基因的作用。
。。
。



手艺蹊径

凭证实验目的设计实验计划—展望连系位点--构建野生/突变报告基因载系一切---共转染细胞---检测酶活



常见应用偏向总结

（1）验证miRNA同mRNA靶向互作。
。。
。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，，，，，再共转入该miRNA，，，，，若是萤光素酶活性下降，，，，，则提醒为其靶序列。
。。
。 

（2） 验证miRNA同circRNA靶向互作。
。。
。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，，，，，检测萤光素酶活性。
。。
。 

（3） 验证miRNA同lncRNA靶向互作。
。。
。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，，，，，检测萤光素酶活性。
。。
。

（4）启动子活性剖析。
。。
。将启动子区域序枚举行分段截短，，，，，再划分构建入报告基因载体，，，，，检测其启动子活性。
。。
。

（5） 验证特定转录因子同启动子的作用。
。。
。将启动子区域插入报告基因载体，，，，，同时在实验细胞中共转该转录因子，，，，，剖析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
。。
。 

（6）剖析信号通路是否激活。
。。
。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，，，，，在差别上游信号条件下，，，，，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。
。。
。